Набор для двухэтапного контрастирования «BioREE-B»

Описание

Колония Staphylococcus aureus на эксплантированном дренаже

Набор «BioREE-B» – один из продуктов серии BioREE™ для суправитального лантаноидного контрастирования биологических объектов, которое позволяет визуализировать на сканирующем электронном микроскопе (SEM) структуру подповерхностного слоя образцов, а также элементы их внутреннего строения без предварительной фиксации / обезвоживания / напыления.

Использование набора «BioREE-B» для двухэтапного контрастирования биологических объектов позволяет не только получить высококонтрастное SEM-изображение с расширенной информацией о структуре клеток, но и сравнительно оценить их метаболическую активность и функциональный статус.

Набор «BioREE-B» также применим для изучения патогенных микроорганизмов за счет наличия в протоколе набора этапа постфиксации образца.

Область применения

Набор реактивов «BioREE-B» предназначен для подготовки биологических образцов к исследованию на сканирующем электронном микроскопе (SEM). Классифицируется как лантаноидный с дополнительным шагом контрастирования солями свинца. В ходе окрашивания выделенные из организма ткани помещают в условия, обеспечивающие протекание в них основных жизненных процессов, и насыщают целевым веществом (суправитальное воздействие), что позволяет в дальнейшем визуализировать методом SEM структуру поверхности, подповерхностного слоя, элементы внутреннего строения, а также получить информацию о сравнительном функциональном статусе клеток в образце. Сопутствующим результатом контрастирования является стабилизация естественного обезвоживания клеток, что предотвращает их деформацию и способствует сохранению их нативного состояния при исследовании.

Набор применим для изучения следующих видов биологических объектов:

Адгезивные клеточные культуры, в том числе на объемных носителях
Адгезивные клеточные культуры, в том числе на объемных носителях
Культуры микроорганизмов, в том числе биопленкообразующих
Суспензионные клеточные культуры
Послеоперационный материал (биоптаты, экспланты)
Мазки-отпечатки с поверхности слизистых

Полученные при помощи реактивов набора контрастированные препараты предназначены для исследования на сканирующих электронных микроскопах (SEM), имеющих режим низкого вакуума (поддержание 55–90 Па) и детектор обратно-рассеянных электронов (BSE).

Ограничения применения. Лантаноидное контрастирование не может применяться к фиксированным тканевым блокам. Также, в связи с агрессивным замещением лантаноидами кальция в фосфатах не рекомендуется использование набора для объектов на фосфатных подложках, а также при изучении костей и зубов. Дополнительным требованием к носителю является его устойчивость к слабокислым условиям среды ввиду присутствия в наборе реактива с рН 5.

Результаты применения (галерея)

Колония Staphylococcus aureus на поверхности полипропиленового катетера (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Corynebacterium diphtheriae (биовар mitis) на лабораторном пластике (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Staphylococcus pneumoniae на лабораторном пластике:
видны клетки на разных этапах деления (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Klebsiella pneumoniae на лабораторном пластике:
видны отличия в метаболической активности клеток (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Pseudomonas aeruginosa на лабораторном пластике:
видны отличия в метаболической активности клеток разных размеров (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Acinetobacter baumannii на лабораторном пластике:
видны отличия в метаболической активности клеток разных размеров (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Corynebacterium diphtheriae (биовар mitis) на лабораторном пластике: видны адгезированные коринебактерии (корд-фактор) (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Candida albicans (тканевая форма) на лабораторном пластике:
видны межклеточные контакты (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Отпечаток слизистой языка на пластике с адгезивным покрытием: крупные клетки слущивающегося эпителия окружены колониями бактерий (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Мазок-отпечаток роговицы на пластике с адгезивным покрытием:
пласт эпителиальных клеток с фрагментами микрофлоры (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Salmonella sp., культивируемая в среде с высоким содержанием глюкозы, на поверхности углеродного скотча (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Bacillus cereus на лабораторном пластике: видны отличия в метаболической активности клеток разных размеров (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Нейтрофил человека, фагоцитирующий колонию клеток Staphylococcus aureus, на культураьном пластике
(Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Мазок-отпечаток роговицы на пластике с адгезивным покрытием:
эпителиальная клетка, окруженная бактериями (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колонии микроорганизмов на поверхности эксплантированного дренажа из слезных путей человека
Колонии микроорганизмов на поверхности эксплантированного дренажа из слезных путей человека
Мицеллярная форма Candida albicans на лабораторном пластике (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Колония Staphylococcus aureus, осажденная на культураьном пластике (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Клетки линии Pv11 (клетки эмбриональной массы личинок комара) на культуральном пластике
Клетки линии Pv11 (клетки эмбриональной массы личинок комара) на культуральном пластике
Корень волоса человека на поверхности углеродного скотча (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)
Скаффолд c мезенхимальными стволовыми клетками (MMSC) пульпы молочного зуба человека на нейлоновом фильтре (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)

Приведенные образцы результатов исследований получены на электронном микроскопе Zeiss EVO LS10 в лаборатории фундаментальных исследований ФГБНУ «НИИГБ».

Протокол использования

Процесс контрастирования с использованием набора «BioREE-B» занимает не более 1 часа. При необходимости долговременного хранения образца и/или при работе с патогенными организмами в протоколе набора предусмотрен дополнительный этап постфиксации. Высокая информативность контрастирования обеспечивается только при использовании в качестве исследуемого объекта живых (нефиксированных) клеток.

Подготовка образцов биологического материала:
Допустимо размещение исследуемых объектов (тонких тканевых проб толщиной до 1 мм, культивируемых или первично полученных клеток и др.) на пластике любого типа, силикатном стекле, в том числе с покрытием, а также на углеродных и полимерных скаффолдах на нефосфатной основе. Также носитель образца должен быть устойчив к слабокислым условиям среды.

Последовательность проведения анализа:

  1. Первичная промывка образца изотоническим раствором хлорида натрия
    (для удаления сорбировавшихся на поверхности образца компонентов ростовых сред и жидкостей основного вещества, содержащих фосфат-ионы, и предотвращения нежелательного связывания с ними тропных к фосфатам контрастирующих ионов лантаноида и свинца).
  2. Помещение образца в водный изотонический раствор хлорида неодима (или др. Ln3+), экспозиция – 30 мин.
    Прим.: для получения лучшего результата следует проводить контрастирование в условиях, максимально приближенным к физиологическим для данного клеточного типа.
  3. Первая промежуточная промывка образца в дистиллированной воде
    (для удаления излишков 1-го контрастирующего вещества).
  4. Помещение образца в водный изотонический раствор ацетата свинца, экспозиция – 15 мин.
    Прим.: образцы, прикрепленные к подложкам, рекомендуется погружать в раствор в перевернутом виде, не допуская при этом соприкосновения поверхности образца с дном емкости.
  5. Вторая промежуточная промывка образца в дистиллированной воде
    (для удаления излишков 2-го контрастирующего вещества).
  6. Помещение образца в фиксирующий раствор
    (при необходимости долговременного хранения образца и/или при работе с патогенными организмами).
  7. Финальная промывка образца в дистиллированной воде
    (для удаления остатков фиксирующего реагента) в течение 1–10 сек.

После осуществления контрастирования с поверхности образца удаляют избыток воды, затем размещают его на предметном столике микроскопа и проводят сканирующую электронную микроскопию в режиме низкого вакуума при ускоряющем напряжении 15–30 кВ и с использованием детектора обратно-рассеянных электронов (BSE).

Более подробную информацию о подготовке образцов, проведении анализа и визуализации полученных препаратов на SEM можно получить, обратившись к следующим документам:

  • Инструкция к набору «BioREE-B» (eng / rus)
  • Протокол контрастирования (rus)
  • Протокол визуализации контрастированных образцов на SEM (rus)

Механизм контрастирования

Схема диагональных рядов химического изоморфизма (по Ферсману А.Е.)

Лантоноидное контрастирование живых (нефиксированных) клеток осуществляется при использовании невысоких концентраций растворимых солей металлов этой группы (хлоридов лантана (LaCl3), неодима (NdCl3) и др.), воздействие которых не приводит к мгновенной гибели исследуемых клеток, а постепенно «выключает» в них энергозависимые процессы.

В соответствии с принципом универсального химического изоморфизма, примененного в отношении живых систем, при обработке клетки ионами лантаноида в ее структурах происходит гетеровалентное замещение ионов кальция:

3Ca2+ ↔ 2La3+,
2Ca2+ ↔ La3+ + Me+.

Вследствие этого наблюдается повышение контрастности образца при проведении SEM, в основе которого лежит не только более высокий атомный номер лантаноида по сравнению с замещаемым кальцием, но и бóльшая эффективность связывания его в неорганических и металлоорганических соединениях.

Одной из мишеней для гетеровалентного замещения являются кальциевые сочленения между пятичленными зонами белка кадгерина (компонента адгезивных контактов).

Также подобные реакции наблюдаются в участках клеточной мембраны, где располагаются кальциевые АТФазы и происходит одновременный транспорт двух ионов кальция. Данная система захватывает лантаноид в паре с щелочным металлом, и в точке деления этого канала на две ветви с независимым транспортом Ca2+ лантаноид уже не имеет возможности покинуть ее, оставаясь связанным с АТФ.

Другая мишень накопления лантаноида в клетке – зоны расположения волокон цитоскелета. Стоит отметить, что размер визуализируемых структур будет превышать реальный размер микротрубочек. Предполагается, что это – своеобразное «гало» связанных фосфат-анионов вокруг элементов цитоскелета, которые высвободились в процессе сборки микротрубочек и образуют нерастворимые соединения с ионами лантаноидов, ярко маркируя расположение микротрубочек и/или статистические направления их сборки.
Таким образом, один только первый этап контрастирования с набором «BioREE-B» позволяет повысить контрастность получаемого изображения методом SEM в режиме BSE более чем в 2 раза.

Применение же водного раствора ацетата свинца в качестве 2-го шага контрастирования протокола набора «BioREE-B» позволяет еще больше увеличить контрастность получаемых изображений в результате протекания следующих реакций:
а) реакции вытеснения свинцом лантаноида в простых фосфатах по принципу наименьшей растворимости:

3Pb2+ + 2Ln[PO4]↓ → 2Ln3+ + Pb3[PO4]2
при ПР(Ln[PO4]) = 3.7·10 – 23;
ПР(Pb3[PO4]2) = 7.9·10 – 43.

Стоит отметить, что на два фосфат-аниона будет приходиться три катиона свинца против двух катионов лантаноидов. Эта реакция преимущественно увеличивает яркость в обратно-рассеянных электронах элементов цитоскелета и митохондрий как объектов, пространственно связанных с большим количеством свободных фосфат-анионов. Таким образом, при «докрашивании» препарата ацетатом свинца фосфатные сайты связывания лантаноида становятся заметно контрастнее.

б) реакции взаимодействия глюкозидов с ацетатом свинца, протекающей по типу реакции Барфеда с катионами меди:

CH2OH(CHOH)4COH + Pb(CH3COO)2 + 2H2O ⇒ CH2OH(CHOH)4COOH + PbO↓ + 4CH3COOH .

Мишенью для реакций этого типа в клетках и экстрацеллюлярном матриксе будут служить глюкоза, фосфолипиды и биохимические элементы, участвующие в энергетическом обеспечении клетки, которые располагаются преимущественно в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме. Контрастность этих зон повышается за счет образования оксида свинца.

СЭМ-изображения в режиме BSE культуры Staphylococcus aureus АТСС 29213

(ширина поля зрения – 18 мкм; во врезках – гистограммы частот распределения яркости, построенные для соответствующего изображения; ускоряющее напряжение 20 кВ, низкий вакуум (70 Па), ток – 120 пА)

После лантаноидного контрастирования (протокол набора BioREE)
После лантаноидного контрастирования (протокол набора BioREE)
После лантаноидного контрастирования и обработки ацетатом свинца (протокол набора BioREE-B)
После лантаноидного контрастирования и обработки ацетатом свинца (протокол набора «BioREE-B»)

Таким образом, помимо основных структур, визуализацию которых обеспечивает специфическое накопление лантаноидов в клетке (ядрышек, зон межклеточных контактов, расположения в клеточных мембранах Ca-насосов и следов сборки цитоскелета), этап «докрашивания» свинцом добавляет целую группу доступных для визуализации структур, ответственных за энергетическое состояние клетки. Данный факт позволяет проводить сравнительный анализ активности метаболизма клеток разных типов в одном образце.

Смешанная культура клеток стромы роговицы человека и линии A549 (карциномы легких человека):

раковые клетки на изображении имеют более интенсивную окраску в связи с более высокой метаболической активностью

СЭМ-изображение, протокол набора «BioREE-B»
СЭМ-изображение, протокол набора «BioREE-B»

Процесс контрастирования (видео)

Патент RU 2672356 C1
http://www1.fips.ru/wps/PA_FipsPub/res/Doc/IZPM/RUNWC1/000/000/002/672/356/%D0%98%D0%97-02672356-00001/document.pdf
Заявка на международный патент № PCT/RU2019/000119 (от 22/02/2019)

https://patentscope.wipo.int/search/ru/detail.jsf?docId=WO2019177492&_cid=P20-K1G5WZ-12570-1

Список публикаций

  1. Последовательное маркирование ультраструктуры биологических объектов неодимом и свинцом в двухступенчатой схеме подготовки для сканирующей электронной микроскопии / Новиков И.А., Суббот А.М., Чеботарь И.В., Пак О.А. // Аналитика 2018, Т. 8, № 4(41), с. 358–363.
    DOI: 10.22184/2227-572X.2018.41.4.358.363
    http://www.j-analytics.ru/journal/article/6981
  2. Патент 2018108571, 12.03.2018. Способ подготовки биологического образца к исследованию при помощи сканирующей электронной микроскопии / Новиков И.А., Суббот А.М., Чеботарь И.В., Пак О.А., Бурсов А.И., Ситников А.В. // Патент России № 2672356, 2018. Бюл. № 32.
    http://www1.fips.ru/wps/PA_FipsPub/res/Doc/IZPM/RUNWC1/000/000/002/672/356/%D0%98%D0%97-02672356-00001/document.pdf
  3. Fast and easy visualization method of impression cytology probe with microbiota detection on the ocular surface / Yugay N.M., Novikov I.A., Subbot A.M., Khalatyan K.S. // 26th International Student Congress Of (bio)Medical Sciences, Groningen (Netherlands), 2019, p. 412.
    https://www.researchgate.net/publication/333320273_Fast_and_easy_visualization_method_of_impression_cytology_probe_with_microbiota_detection_on_the_ocular_surface
  4. A rapid method of whole cell sample preparation for scanning electron microscopy using neodymium chloride / Chebotar I.V., Novikov I.A., Subbot A.M., Mayansky N.A. // Micron 2019, 124. DOI: 10.1016/j.micron.2019.102687
    https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968432818303111  

Дополнительная информация

  • Инструкция к набору «BioREE-B» (rus / eng)
  • Паспорт безопасности продукции BioREE™ (SDS) (rus / eng)
  • Отчет компании Zeiss о тестировании набора «BioREE» (eng)

Купить набор BioREE-B

Стоимость набора «BioREE-B» — 5000 руб (без учёта доставки).
Подробности приобретения для юридических лиц находятся в разделе Покупка
Физические лица могут приобрести набор через сайт нашего партнёра.