Набор контрастирования биологических объектов

Реагент позволяет выявлять неблагоприятные изменения и скрытые проблемы на уровне микроструктуры тканей, сырья и материала.

Область применения

Набор реактивов «BioREE-B» предназначен для подготовки биологических образцов к исследованию на сканирующем электронном микроскопе (SEM). Классифицируется как лантаноидный с дополнительным шагом контрастирования солями свинца. В ходе окрашивания выделенные из организма ткани помещают в условия, обеспечивающие протекание в них основных жизненных процессов, и насыщают целевым веществом (суправитальное воздействие), что позволяет в дальнейшем визуализировать методом SEM структуру поверхности, подповерхностного слоя, элементы внутреннего строения, а также получить информацию о сравнительном функциональном статусе клеток в образце. Сопутствующим результатом контрастирования является стабилизация естественного обезвоживания клеток, что предотвращает их деформацию и способствует сохранению их нативного состояния при исследовании.

Набор применим для изучения следующих видов биологических объектов:

Адгезивные клеточные культуры, в том числе на объемных носителях
Культуры микроорганизмов, в том числе биопленкообразующих
Суспензионные клеточные культуры
Послеоперационный материал (биоптаты, экспланты)
Мазки-отпечатки с поверхности слизистых

Полученные при помощи реактивов набора контрастированные препараты предназначены для исследования на сканирующих электронных микроскопах (SEM), имеющих режим низкого вакуума (поддержание 55–90 Па) и детектор обратно-рассеянных электронов (BSE).

Ограничения применения. Лантаноидное контрастирование не может применяться к фиксированным тканевым блокам. Также, в связи с агрессивным замещением лантаноидами кальция в фосфатах не рекомендуется использование набора для объектов на фосфатных подложках, а также при изучении костей и зубов. Дополнительным требованием к носителю является его устойчивость к слабокислым условиям среды ввиду присутствия в наборе реактива с рН 5.

Результаты применения

Приведенные образцы результатов исследований получены на электронном микроскопе Zeiss EVO LS10 в лаборатории фундаментальных исследований ФГБНУ «НИИГБ»

Колония Staphylococcus aureus на поверхности полипропиленового катетера (Набор «BioREE-B», СЭМ-изображение, режим BSE)

Протокол использования

Процесс контрастирования с использованием набора «BioREE-B» занимает не более 1 часа. При необходимости долговременного хранения образца и/или при работе с патогенными организмами в протоколе набора предусмотрен дополнительный этап постфиксации. Высокая информативность контрастирования обеспечивается только при использовании в качестве исследуемого объекта живых (нефиксированных) клеток.

Подготовка образцов биологического материала

Допустимо размещение исследуемых объектов (тонких тканевых проб толщиной до 1 мм, культивируемых или первично полученных клеток и др.) на пластике любого типа, силикатном стекле, в том числе с покрытием, а также на углеродных и полимерных скаффолдах на нефосфатной основе. Также носитель образца должен быть устойчив к слабокислым условиям среды.

Последовательность проведения анализа

1. Первичная промывка образца изотоническим раствором хлорида натрия (для удаления сорбировавшихся на поверхности образца компонентов ростовых сред и жидкостей основного вещества, содержащих фосфат-ионы, и предотвращения нежелательного связывания с ними тропных к фосфатам контрастирующих ионов лантаноида и свинца).

2. Помещение образца в водный изотонический раствор хлорида неодима (или др. Ln3+), экспозиция – 30 мин. Прим.: для получения лучшего результата следует проводить контрастирование в условиях, максимально приближенным к физиологическим для данного клеточного типа.

3. Первая промежуточная промывка образца в дистиллированной воде (для удаления излишков 1-го контрастирующего вещества).

4. Помещение образца в водный изотонический раствор ацетата свинца, экспозиция – 15 мин. Прим.: образцы, прикрепленные к подложкам, рекомендуется погружать в раствор в перевернутом виде, не допуская при этом соприкосновения поверхности образца с дном емкости.

5. Вторая промежуточная промывка образца в дистиллированной воде (для удаления излишков 2-го контрастирующего вещества).

6. Помещение образца в фиксирующий раствор (при необходимости долговременного хранения образца и/или при работе с патогенными организмами).

7. Финальная промывка образца в дистиллированной воде (для удаления остатков фиксирующего реагента) в течение 1–10 сек.

После осуществления контрастирования с поверхности образца удаляют избыток воды, затем размещают его на предметном столике микроскопа и проводят сканирующую электронную микроскопию в режиме низкого вакуума при ускоряющем напряжении 15–30 кВ и с использованием детектора обратно-рассеянных электронов (BSE).

Процесс контрастирования

Патент RU 2672356 C1

Механизм контрастирования

Лантаноидное контрастирование живых (нефиксированных) клеток осуществляется при использовании невысоких концентраций растворимых солей металлов этой группы (хлоридов лантана (LaCl₃), неодима (NdCl₃) и др.), воздействие которых не приводит к мгновенной гибели исследуемых клеток, а постепенно «выключает» в них энергозависимые процессы.

Схема диагональных рядов химического изоморфизма (по Ферсману А. Е.)

В соответствии с принципом универсального химического изоморфизма, примененного в отношении живых систем, при обработке клетки ионами лантаноида в ее структурах происходит гетеровалентное замещение ионов кальция:

3Ca²⁺ ↔︎ 2La³⁺, 2Ca²⁺ ↔︎ La³⁺ + Me⁺.

Вследствие этого наблюдается повышение контрастности образца при проведении SEM, в основе которого лежит не только более высокий атомный номер лантаноида по сравнению с замещаемым кальцием, но и бóльшая эффективность связывания его в неорганических и металлоорганических соединениях.

Одной из мишеней для гетеровалентного замещения являются кальциевые сочленения между пятичленными зонами белка кадгерина (компонента адгезивных контактов).

Пассивное химическое замещение кальция лантаноидом

Также подобные реакции наблюдаются в участках клеточной мембраны, где располагаются кальциевые АТФазы и происходит одновременный транспорт двух ионов кальция. Данная система захватывает лантаноид в паре с щелочным металлом, и в точке деления этого канала на две ветви с независимым транспортом Ca²⁺ лантаноид уже не имеет возможности покинуть ее, оставаясь связанным с АТФ.

Другая мишень накопления лантаноида в клетке — зоны расположения волокон цитоскелета. Стоит отметить, что размер визуализируемых структур будет превышать реальный размер микротрубочек. Предполагается, что это — своеобразное «гало» связанных фосфат-анионов вокруг элементов цитоскелета, которые высвободились в процессе сборки микротрубочек и образуют нерастворимые соединения с ионами лантаноидов, ярко маркируя расположение микротрубочек и/или статистические направления их сборки.

Ингибирование бинарного транспорта кальция

Таким образом, один только первый этап контрастирования с набором «BioREE-B» позволяет повысить контрастность получаемого изображения методом SEM в режиме BSE более чем в 2 раза.

Применение же водного раствора ацетата свинца в качестве 2-го шага контрастирования протокола набора «BioREE-B» позволяет еще больше увеличить контрастность получаемых изображений в результате протекания следующих реакций:

а) реакции вытеснения свинцом лантаноида в простых фосфатах по принципу наименьшей растворимости:

3Pb²⁺ + 2Ln[PO₄]↓︎ →︎ 2Ln³⁺ + Pb₃[PO₄]₂↓︎ при ПР(Ln[PO₄]) = 3,7 · 10⁻²³; ПР(Pb₃[PO₄]₂) = 7,9 · 10⁻⁴³.

Стоит отметить, что на два фосфат-аниона будет приходиться три катиона свинца против двух катионов лантаноидов. Эта реакция преимущественно увеличивает яркость в обратно-рассеянных электронах элементов цитоскелета и митохондрий как объектов, пространственно связанных с большим количеством свободных фосфат-анионов. Таким образом, при «докрашивании» препарата ацетатом свинца фосфатные сайты связывания лантаноида становятся заметно контрастнее.

Необратимая сборка микротрубочек в присутствии лантаноида

б) реакции взаимодействия глюкозидов с ацетатом свинца, протекающей по типу реакции Барфеда с катионами меди:

CH₂OH(CHOH)₄COH+Pb(CH₃COO)₂+2H₂O⇒︎CH₂OH(CHOH)₄COOH+PbO↓︎+4CH₃COOH

Мишенью для реакций этого типа в клетках и экстрацеллюлярном матриксе будут служить глюкоза, фосфолипиды и биохимические элементы, участвующие в энергетическом обеспечении клетки, которые располагаются преимущественно в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме. Контрастность этих зон повышается за счет образования оксида свинца.

СЭМ-изображения в режиме BSE культуры Staphylococcus aureus АТСС 29213

Ширина поля зрения — 18 мкм; во врезках — гистограммы частот распределения яркости, построенные для соответствующего изображения; ускоряющее напряжение 20 кВ, низкий вакуум (70 Па), ток — 120 пА.

Культура Staphylococcus aureus после лантаноидного контрастирования — После лантаноидного контрастирования (протокол набора BioREE)

Культура Staphylococcus aureus после лантаноидного контрастирования и обработки ацетатом свинца — После лантаноидного контрастирования и обработки ацетатом свинца (протокол набора «BioREE-B»)

Таким образом, помимо основных структур, визуализацию которых обеспечивает специфическое накопление лантаноидов в клетке (ядрышек, зон межклеточных контактов, расположения в клеточных мембранах Ca-насосов и следов сборки цитоскелета), этап «докрашивания» свинцом добавляет целую группу доступных для визуализации структур, ответственных за энергетическое состояние клетки. Данный факт позволяет проводить сравнительный анализ активности метаболизма клеток разных типов в одном образце.

Смешанная культура клеток стромы роговицы человека и линии A549 (карциномы легких человека)

Раковые клетки на изображении имеют более интенсивную окраску в связи с более высокой метаболической активностью.

Научные публикации

Последовательное маркирование ультраструктуры биологических объектов неодимом и свинцом в двухступенчатой схеме подготовки для сканирующей электронной микроскопии / Новиков И.А., Суббот А.М., Чеботарь И.В., Пак О.А. // Аналитика 2018, Т. 8, № 4(41), с. 358–363.

DOI: 10.22184/2227-572X.2018.41.4.358.363

j-analytics.ru

Способ подготовки биологического образца к исследованию при помощи сканирующей электронной микроскопии / Новиков И.А., Суббот А.М., Чеботарь И.В., Пак О.А., Бурсов А.И., Ситников А.В. // Патент России № 2672356, 2018. Бюл. № 32.

fips.ru

Fast and easy visualization method of impression cytology probe with microbiota detection on the ocular surface / Yugay N.M., Novikov I.A., Subbot A.M., Khalatyan K.S. // 26th International Student Congress Of (bio)Medical Sciences, Groningen (Netherlands), 2019, p. 412.

researchgate.net

A rapid method of whole cell sample preparation for scanning electron microscopy using neodymium chloride / Chebotar I.V., Novikov I.A., Subbot A.M., Mayansky N.A. // Micron 2019, 124. DOI: 10.1016/j.micron.2019.102687

sciencedirect.com