Новая жизнь Вашего high-energySEM

Лантаноидный контраст

для сканирующей электронной микроскопии биологических образцов

Как это работает?

Ингибирование кальциевых насосов лантаноидами хорошо изучено и широко применяется в экспериментальной биологии. Именно это свойство лантаноидов лежит в основе предлагаемого нами метода контрастирования. Первые попытки такого рода предпринимались еще во времена, когда сканирующие микроскопы не имели режимов низкого вакуума [Doggenweiler CF, Frenk S Staining properties of lanthanum on cell membranes. Proc NatI Acad Sci USA 3:425, 1965], в связи с чем не имели особенного успеха.

Механизм взаимодействия образца с контрастом можно вкратце описать следующим образом: в процессе жизнедеятельности клетки в ее метаболизм вовлекается трехвалентный ион лантаноида в паре с щелочным металлом, который в некоторых цепочках замещает парный транспорт двух ионов кальция, вдвое увеличивая контрастность кальциевых насосов в режиме детекции обратно-рассеянных электронов.

Кроме того, лантаноиды проявили способность замещать кальций в белках типа кадгерина и связываться с фосфорными остатками гидролиза ГТФ, что обеспечивает хорошую визуализацию межклеточных контактов и внутриклеточного цитоскелета, соответственно.

В ряде случаев, а именно при контрастировании клеточных структур и небольших образцов нами было замечено интересное явление — биологические объекты практически перестают терять воду и сохраняют естественную форму даже в условиях глубокого вакуума. В течение нескольких часов не наблюдается ни контракции, ни трещин на поверхности, ни каких-либо других артефактов!

Фундаментальные основы этого явления не вполне понятны, но можно предположить, что основные системы обмена клетки, будучи полностью ингибированы лантаноидами, не функционируют, что, с одной стороны, ограничивает проницаемость мембран, а с другой, формирует статичные потенциалы на белковых молекулах, которые удерживают структурированную воду внутри клетки.

Таким образом, лантаноиды можно рассматривать как мягкий фиксирующий агент, делающий визуализацию более простой и технологичной.

Мы существенно модифицировали метод лантаноидного контрастирования под актуальный уровень техники и собрали для Вас удобный набор необходимых реактивов.

Для каких объектов это подходит?

Предлагаемый нами метод суправитального лантаноидного контрастирования универсален. Особенно хорошие результаты мы получили при оценке активности межклеточных контактов и внутриклеточных структур эпителия, а также визуализации поверхности кишечнополостных.

Оптимальным объектом для изучения, на наш взгляд, является монослой клеток на культуральном пластике или тканеинженерная конструкция, например, углеродная матрица, заселенная клетками.

Для каких объектов это не подходит**?

Суправитальное лантаноидное контрастирование, как следует из названия, не может применяться к фиксированным тканевым блокам.

Кроме того, в связи с агрессивным замещением лантаноидами кальция в фосфатах мы не рекомендуем использовать данную схему контрастирования для объектов на фосфатных подложках, а также при изучении костей.

**В процессе работы Вы, вероятно, обнаружите и другие объекты, не поддающиеся контрастированию по нашей схеме. Пожалуйста, сообщите нам о них!

Интерпретация получаемых изображений на примере группы клеток
(астроциты человека на культуральном пластике)

a. Видны тонкие выросты цитоплазмы, очерченные линией более яркой цитоплазматической мембраны.

b. Округлые митохондрии (на изображениях с большим увеличением вы сможете увидеть, что их внутренняя структура окрашивается неравномерно за счет наличия крист).

a. Ядерная мембрана и кариоплазма в целом имеют более светлый фототон по сравнению со свободной цитоплазмой. В структуре ядра видны многочисленные яркие ядрышки разнообразной формы, На все объекты в центре клетки накладывется изображение цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭПР).

b. Сеть взаимосвязанных цистерн ЭПР и комплекса Гольджи сложной формы, окружающих зону вокруг ядра.

a. «Пустоты» округлой формы, очерченные более ярким кантом, отмечают расположение лизосом.

b. Среди цитоплазматических органелл можно увидеть митохондрии, часто пространственно ассоциирующие с цитоскелетом.

c. Протяженные структуры показывают позицию цитоскелета (оттрассированы красным пунктиром).